8月15日，中國科學(xué)院腦科學(xué)與智能技術(shù)卓越創(chuàng)新中心楊輝團(tuán)隊與復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院黃錦海團(tuán)隊等合作，在《自然-化學(xué)生物學(xué)》（Nature Chemical Biology）上發(fā)表了題為Engineered IscB–ωRNA system with expanded target range for base editing的研究論文。該研究通過宏基因組數(shù)據(jù)挖掘，鑒定出19種具有不同TAM范圍的新型IscB-ωRNA系統(tǒng)；綜合利用RNA結(jié)構(gòu)優(yōu)化、蛋白質(zhì)工程化改造、流式細(xì)胞術(shù)、脫靶檢測等技術(shù)手段，獲得了在人類細(xì)胞內(nèi)具有靶標(biāo)識別范圍廣、更高效編輯活性的IscB系統(tǒng)（IscB.m16*）；通過融合脫氨酶結(jié)構(gòu)域，進(jìn)一步開發(fā)出基于新型IscB的迷你型腺嘌呤和胞嘧啶堿基編輯器，并在哺乳動物細(xì)胞和小鼠疾病模型中包括SpCas9-BE無活性的疾病位點上驗證了其堿基編輯效率和靶標(biāo)識別能力，為未來精準(zhǔn)基因治療臨床應(yīng)用提供了支持。CRISPR/Cas9系統(tǒng)自發(fā)現(xiàn)以來，得到了快速發(fā)展，并被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)基礎(chǔ)研究、基因治療、動植物育種改良等領(lǐng)域?；贑as9切口酶（nCas9）與脫氨酶結(jié)構(gòu)域/糖基化酶（MPG或UNG）的融合成的堿基編輯器（ABE、CBE、gGBE、gTBE），可高效實現(xiàn)A-to-G、C-to-T、C-to-G、G-to-C/T及T-to-G/C的堿基替換，為糾正突變的疾病位點提供了精準(zhǔn)高效的基因編輯工具。然而，由于Cas9的體積過大，基于nCas9的堿基編輯器難以實現(xiàn)單個腺相關(guān)病毒（AAV）的包裝遞送，限制了在體基因編輯的發(fā)展應(yīng)用。近年來，一系列緊湊型的Cas9蛋白、Cas12f系列同源物及其祖先蛋白TnpB被報道，但由于編輯活性有限或者缺乏HNH結(jié)構(gòu)域而難以改造為缺口酶，限制了其用于堿基編輯器的開發(fā)。IscB-ωRNA系統(tǒng)需要嚴(yán)格的6位堿基靶序列鄰近基序（TAM）來識別目標(biāo)DNA，且識別位點有限。因此，開發(fā)靶標(biāo)識別范圍更廣的高效小型IscB堿基編輯器較為重要。該研究在200GB的宏基因組數(shù)據(jù)庫中挖掘出19個未被表征的新型IscB系統(tǒng)，采用細(xì)菌耗竭實驗鑒定相應(yīng)的TAM序列。進(jìn)一步，研究利用熒光報告系統(tǒng)，篩選出10個具有真核細(xì)胞活性的IscB系統(tǒng)。其中，IscB.m16表現(xiàn)出最高的編輯活性。為提高IscB.m16系統(tǒng)的活性并拓寬TAM范圍，研究對IscB.m16核酸酶進(jìn)行RuvC結(jié)構(gòu)域的精氨酸掃描突變和TAM識別相關(guān)位點的飽和突變，并對其ωRNA進(jìn)行莖環(huán)截短和堿基替換的優(yōu)化改造。通過多輪迭代的高通量熒光報告系統(tǒng)篩選，研究獲得了編輯活性高和TAM范圍寬的IscB.m16變體。細(xì)菌消耗TAM實驗發(fā)現(xiàn)，相較于野生型IscB.m16，TAM從MRNRAA擴(kuò)展到NNNGNA。在此基礎(chǔ)上，該研究構(gòu)建了迷你型腺嘌呤堿基編輯器和胞嘧啶堿基編輯器。哺乳動物細(xì)胞中，迷你型腺嘌呤堿基編輯器的堿基編輯效率與SpG-ABE效率相當(dāng)，高于已報道的enOgeuIscB-ABE，具有更廣的TAM兼容性。在人源化杜氏肌營養(yǎng)不良癥（DMD）小鼠疾病模型中，單AAV包裝的胞嘧啶堿基編輯器經(jīng)注射至肌肉組織后，將小鼠肌纖維中抗肌營養(yǎng)不良蛋白水平恢復(fù)至野生型小鼠的40%，為DMD患者提供了有希望的基因治療策略。該研究通過挖掘和優(yōu)化改造新型IscB系統(tǒng)，開發(fā)出靶向范圍更廣、活性更高、特異性更好的迷你型堿基編輯工具，在基于AAV的基因治療應(yīng)用中展現(xiàn)出潛力。論文鏈接科學(xué)家開發(fā)出靶向范圍更廣的微型堿基編輯器